| 问题 | 可能原因 | 可能采取的措施 |
| 背景高且均一 | 1.抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗/二抗）浓度 |
| 2.封闭液选择不当 | 比较不同封闭液 |
| 3.封闭不* | 根据不同的体系优化封闭液 |
| 提高封闭物浓度 |
| 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 |
| 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 |
| 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 |
| 4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应 | 更换封闭液 |
| avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin |
| 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 |
| 5.清洗不充分 | 增加清洗次数及清洗液体积 |
| 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% |
| 6.曝光时间过长 | 缩短曝光时间 |
| 7.膜出问题 | 确保转膜前，已根据厂商指导将膜*浸润 |
| 更换新膜 |
| 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 |
| 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 |
| 每一步孵育都应确保充分 |
| 8.缓冲液污染或长菌 | 重新配制缓冲液 |
| 背景高，且以斑点形式存在 | 1.抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗/二抗）浓度 |
| 2.封闭液选择不当 | 比较不同封闭液 |
| 3.封闭不* | 根据不同的体系优化封闭液 |
| 提高封闭物浓度 |
| 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 |
| 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 |
| 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 |
| 4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应 | 更换封闭液 |
| avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin |
| 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 |
| 5.膜出问题 | 确保转膜前，已根据厂商建议将膜*浸润 |
| 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 |
| 更换新膜 |
| 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 |
| 每一步孵育都应确保充分 |
| 膜过多时，应避免相互堆叠 |
| 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 |
| 6.缓冲液污染 | 使用新的缓冲液 |
| 用前过滤 |
| 7.仪器污染 | 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 |
| 确保转膜后膜上没有残留的胶 |
| 信号弱或无信号 | 1.转膜效率低 | 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 |
| 转膜时胶与膜应充分接触 |
| 确保转膜时滤纸与膜装配正确 |
| 按厂商指导将膜充分浸润 |
| 转膜体系在转膜过程中避免过热 |
| 使用阳性对照和（或）分子量marker |
| 优化转膜时间和电流 |
| 确保在抗体杂交前的样品制备条件没有破坏样品的抗原性（注意：某些蛋白不能在变性条件下电泳） |
| 2.蛋白与膜结合不充分 | 在转膜缓冲液中添加20%的甲醇 |
| 低分子量的蛋白使用孔径较小的膜 |
| | 3.抗体量不足 | 增加抗体浓度 |
| 抗体可能已经失效，通过点杂交确定抗体活性 |
| 4.抗体浓度过高 | 抗体浓度过高会导致信号迅速减弱，造成信号弱的假象 |
| 5.抗原量不足 | 增加上样量 |
| 6.抗原被封闭液掩盖 | 更换封闭液 |
| 优化封闭液浓度 |
| 7.缓冲液中含有* | *是辣根过氧化酶的抑制剂 |
| 8.曝光时间过短 | 延长曝光时间 |
| 9.底物反应时间过短 | 延长反应时间至5分钟 |
| 10.底物失活 | 检查底物活性 |
| 确保两瓶底物之间没有交叉污染 |
| 11.剥膜造成影响 | 剥膜造成有些抗原丢失或变性，优化剥膜过程 |
| 仅在必需时剥膜重杂 |
| 避免反复剥同一张膜 |
| 12.膜上抗原降解 | 某些封闭物具有蛋白水解活性（如gelatin） |
| 13.转好的膜存放时间过长 | 重新电泳转膜 |
| 非特异性条带 | 1. 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 |
| 2.SDS造成非特异性结合 | 转膜结束后清洗膜 |
| 免疫反应过程中避免使用SDS |
| 3. 二抗试剂的非特异结合 | 更换二抗 |
| 4.一抗特异性差 | 采用单抗或亲和纯化的抗体 |
| 弥散条带 | 1.抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 |
| 2.上样量过高 | 减少上样量 |
| 条带曝空或淬灭迅速 | 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度，尤其是二抗浓度 |
| 仅局部区域有信号 | 转膜不* | 确保在胶和膜之间没有气泡 |
| 根据厂商指导将膜*浸润 |
| 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 |
| 更换新膜 |
| 膜过多时，应避免相互堆叠 |
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